冷冻保存

胚胎、囊胚、精子、卵子都可以放入液氮中冷冻保存。
一旦冷冻处理后在液氮中可以半永久地保持原有的状态,因此第一次体外受精时没能受孕或想要第二个孩子的时候可以把冷冻胚胎融解后再次进行移植。

做冷冻处理时如果细胞内生成冰晶,细胞会受到损伤以至死亡。为了在存活的状态下冷冻细胞使用冷冻保护剂。

可在液氮中半永久保存

什么是超急速玻璃化保存法丸按钮

细胞浸透冷冻保护剂后,放入玻璃化液中约1分钟后脱水浓缩。
不形成冰晶,可用液氮瞬间冷冻。

超快速玻璃化保存法

冷冻胚胎的融解 丸按钮

在液氮中把冷冻胚胎恢复到原状。
渗透缓冲液用于防止细胞膜损伤。

冷冻胚胎的融解

冷冻胚胎的三个步骤

1.平衡 使冷冻保护剂渗透胚胎。
2.浓缩・脱水 使细胞内的水分脱离。
3.冷却 冷冻细胞。

胚胎、囊胚、卵子的超急速玻璃化保存法

内容 在渗透了冷冻保护剂后,将细胞置于玻璃化液中,约1分钟使细胞脱水浓缩。在这种状态下,细胞不会形成冰晶,在液氮中瞬间冷冻。

1.平衡
平衡液(ES)--5分钟--使冷冻保护剂渗透胚胎

冷冻保护渗透

2.浓缩・脱水
玻璃化溶液(VS)--1分钟--水分被玻璃化溶液置换,
细胞浓缩(不形成冰晶的状态)

通过更换玻璃化液浓缩细胞

3.冷却
放在载杆上置入液氮中冷冻保存

放在载杆上置入液氮中冷冻保存

缓慢冷冻法

内容 通过渗透冷冻保护剂并在细胞外形成冰晶,使细胞脱水浓缩,并使用名为程序冷冻机的设备以每分钟0.3℃的速度缓慢冷却至-30℃。

缓慢冷冻法使用机器操作,程序固定不变,不费劳力,但是机器不能根据每个胚胎的状态进行微调整,而且冷冻时的渗透压大,因此冷冻胚胎的存活率不是很高。
相反,超急速玻璃化冷冻法虽然要求操作人员手法熟练,但胚胎几乎没有损伤,存活率接近100%。

本院由经验丰富的胚胎培养师采用超急速玻璃化保存法对胚胎、囊胚和卵子实施冷冻。

精子经过耐冻处理后,分注到小试管放入液氮中冷冻保存。

冷冻胚胎的融解

1.加温 融解冷冻胚胎。
2.稀释 把由冷冻保护剂脱水浓缩的细胞恢复到原状。
3.恢复培养 确认细胞是否还原到初始状态并重新开始发育。

液氮中冷冻保存的细胞在融解时如果加温时间太长,会因为去玻璃化使细胞内生成冰晶而损坏细胞,因此采用超急速加温法。
这种方法是通过把冷冻胚胎放入加热到37℃的融解液中,得到相当+4300°c的超急速加温,防止冰晶的生成进而避免物理损伤。
用超急速加温法融解的胚胎细胞由于冷冻保护剂的浓缩作用处于收缩状态,利用溶液的渗透压差的扩散作用稀释去除冷冻保护剂使细胞恢复到初始状态。
胚胎的细胞膜很脆弱,耐不住细胞体积急剧增大膨胀,因此使用不会透过细胞膜的蔗糖作为渗透压缓冲剂逐步稀释。
通过缓慢降低渗透压,防止细胞过度膨胀和细胞膜损伤,获得高存活率。

1.加温

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2.稀释

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3.恢复培养 数小时

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